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王林川|副雞禽杆菌西南強毒菌株的分離鑒定及其免疫保護研究
日期:2020-01-10

作者:王林川、張淑瓊

肇慶大華農生物藥品有限公司


為掌握和分析國內西南區域雞傳染性鼻炎的發生情況及病原的菌型和毒力,課題組對從四川、雲南、廣西送檢的典型腫頭雞病料進行了病菌分離和鑒定,同時對確定為B型副雞禽杆菌的5個分離菌株進行了對100天齡SPF雞的人工感染試驗以確定其毒力,對最強毒力菌株及居中毒力菌株做了對應免疫和相互攻毒保護試驗,為後續的疫苗開發提供科學依據。


1、材料與方法

1.1 病料來源及處理

從四川、雲南、廣西區域5個發病雞場按要求物流快件或專人送檢冷藏的典型腫頭雞頭,3天內貨到實驗室進行病原菌的分離鑒定。

1.2 副雞禽杆菌地方病原菌株的分離鑒定

先對送檢的各個發病腫大雞頭進行副雞禽杆菌通用基因引物、ABC三血清型區分專用基因引物進行PCR擴增鑒定;對鑒定出含有副雞禽杆菌核酸的病雞頭進行病原菌的分離鑒定和純化培養。

1.3 地方分離菌株的毒力測定

將分離菌株分別接種一耳環到各自的10mL專用液體培養基上,按課題組優化的相同培養條件進行相同時間的增殖,用OD值計數法配取一定量活菌數的菌液感染100天齡SPF雞分組測定各菌株的半數感染量(LD50);感染方式為每隻雞眶下竇注射菌液0.2mL,設空白對照組;第二天起觀察連續7天,出現雞腫頭或流淚者判斷為陽性感染。

1.4  2個B型菌株的相互免疫保護試驗

從分離的5株B型菌株選出毒力最強的SC01菌株和居中毒力的GX02菌株,按照<鼻康安>半成品生產的培養條件和要求製做SC01株和GX02株的合格半成品,並用相同菌數及按鼻康安疫苗的製作工藝標準製成了SC01株和GX02株單價苗;將72隻SPF雞10天齡時免疫禽流感(H5+7)三價苗, 30天齡時分成7組, 每組10隻,第1-2組和第3-4組於40天齡和70天齡時分別免疫SC01株和GX02株單價苗0.5mL/隻, 100天齡時第1、3 、5組用半數感染量濃度的SC01菌眶下竇注射菌液0.2mL/隻,第2、4、6組用半數感染量濃度的GX02菌眶下竇注射菌液0.2mL/隻,第7組設為注射滅菌蒸餾水0.2mL/隻的空白對照組;第二天起觀察連續7天,出現雞腫頭或流淚者判斷為陽性感染。

2、結果

2.1 副雞禽杆菌地方分離株情況

經純化及PCR鑒定,分離到5株B型副雞禽杆菌,並命名保存為SC01株、SC02株、YN01株、GX01株、GX02株。同時表明B型菌是西南地區的主流致病菌。

2.2 5株副雞禽杆菌的半數感染量結果見表1


表1  5株副雞禽杆菌的半數感染量(CFU/ml)


數據顯示流行致病的B型菌間毒力差異較大。


2.3 SC01株和GX02株的相互免疫保護情況結果見表2


表2   SC01株和GX02株的相互免疫保護結果


結果顯示SC01株對流行致病菌株有很好的免疫保護力。

3、結論

3.1 西南地區存在較廣泛的B型副雞禽杆菌感染,且感染菌株間毒力有較大差異,有的相差30倍以上。

3.2 SC01株與GX02株同為B型菌,但兩者間的保護性抗原差異近30%,顯示B型菌間還存在有較大變異。

3.3 SC01菌株毒力強、免疫保護力好且廣,是一個性能優良的疫苗候選株。

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